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什么是空間轉錄組測序

空間轉錄組學(Spatial Transcriptomics)是指在組織切片上完成,保留樣本空間信息的組學研究??臻g轉錄組可展示組織切片中不同區域的基因表達情況,揭示精細病理區域中激活的信號通路,完成分子特征驅動病理特征的機制解析??臻g轉錄組學完成了病理數字化結合病理影像化的技術革新,對于診斷標志物、耐藥位點以及靶向藥物的研發,免疫治療等新興領域都具有重要作用。

什么是原位分析技術?

烈冰生物亞細胞原位空間組學技術引進10x genomics Xenium平臺,將新鮮冷凍(FF)和石蠟包埋(FFPE)組織中的數百種RNA進行表達分析并精確到亞細胞(200納米)定位,相較 Visium 空間轉錄組擁有更高的檢測精度,將會對我們理解腫瘤微環境、免疫、神經科學、細胞特異性、生物發育等方面產生深遠的影響,并進入空間單細胞/亞細胞研究的新時代。

設計原理 檢測通量 空間信息保留 實驗成本 代表性技術


空間轉錄組

Spatial barcode標記空間信息

烈冰的空間轉錄組技術

較低

部分
僅顯示切取部位在組織中的空間信息,無細胞內部空間結構

LCM-seq

顯微鏡下切取待檢測組織

LCM-seq、Neo-seq

需激光共聚焦顯微鏡,需經驗豐富人員進行顯微切割操作


FISH-seq

抗體識別,熒光標記

MERFISH、Seq-FISH

受熒光檢測通道限制

針對基因設計探針,需激光共聚焦顯微鏡,需反復雜交和圖像讀取

部分
僅顯示切取部位在組織中的空間信息,無細胞內部空間結構

流式分選

選取特定細胞,需要特異性抗體對細胞進行分選

FACS, INTACT

較低


亞細胞|原位分析

基于Padlock探針的多輪熒光檢測技術

Xenium in situ

目前可檢測多達400個RNA,未來可檢測1000+

基因panel可定制、自動完成熒光探針雜交、成像和解碼

Xenium技術原理概覽

Visium空間轉錄組學的原理

當組織冷凍切片附在帶有spatial barcode的空間轉錄組芯片上時,通過透化處理,細胞內的mRNA釋放出來,從而被芯片上帶有oligo-dT的探針捕獲。被捕獲的mRNA開始逆轉錄,得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通過上機測序,可以將每個mRNA轉錄的序列映射回組織切片中的映射回組織切片中的原始位置。

Visium空間轉錄組的核心在于芯片部分:
  • 正式文庫構建的芯片上有4個捕獲區域(6.5mm X 6.5mm,可以檢測4個樣本)
  • 每個捕獲區域含有約5000個被條形碼標記的點(barcoded spots)
  • 每個spot直徑55μm,每個spot能捕獲1-10個細胞
  • spot與spot中心點之間的距離為100μm
  • 每個spot含有上百萬個可以與mRNA結合的捕獲探針,每個探針上都帶有獨特的spatial barcodes,用以標記捕獲的mRNA的空間位置


Visium FFPE空間轉錄組學的原理

在Visium FFPE組織中,樣本切片需先和預設的探針(probe)雜交,進一步完成連接反應,再透化釋放連接probe與載玻片上的探針結合,從而捕獲基因表達信息。
  • Visium FFPE解決方案針對每一個基因(1.8萬個人類基因以及2萬個小鼠基因),都預先設計了一對probe以靶定RNA的特定序列
  • LHS(左端探針)帶有read2序列,用以后續PCR擴增;RHS(右端探針)帶有polyA序列,用以后續被玻片探針捕獲結合
  • 通過probe與組織內RNA雜交,將RNA信息轉移到probe上,再將探針兩端連接形成完整的DNA鏈。之后降解雜合RNA鏈,透化釋放連接probe

技術難點和烈冰解決方案

無冷凍切片條件可以進行空間轉錄組測序嗎?

01

烈冰提供空間轉錄組全流程服務,包括樣本包埋、貼片、選片、HE染色、拍照成像、組織透化、建庫測序以及后續的FISH驗證等各個步驟,為您提供無憂服務。

冷凍切片質量可否保證?

02

烈冰搭建了以萊卡CM1950冷凍切片機、尼康多熒光通路全自動掃描顯微鏡、3Dhistech-midi數字掃描儀為基礎的先進實驗平臺,并制定嚴格規范的實驗室SOP,經過大量的切片、貼片實操演練,對不同類型組織的切片厚度、溫度進行優化,確保獲得最優質量的冷凍切片。

空間轉錄組測序數據量大,分析困難怎么辦?

03

利用NovelBrain云分析平臺,搭建0代碼需求的空間轉錄組分析流程,準確快速解析空間轉錄組數據。 

空間區域內細胞類型如何判定?

04

取同一樣本組織的相鄰區域進行單細胞轉錄組測序,通過單細胞轉錄組數據和空間轉錄組數據的整合分析,判定空間區域內的細胞類別,精確解析組織空間內的異質化信息。

Xenium分析儀每次運行可分析多少個樣本?

05

每次運行時可分析兩張Xenium載玻片。每張Xenium載玻片上的可成像區域為10.45× 22.45 mm,其上可放置組織切片,因此每張載玻片上可包含多張組織切片。 06 原位空間組學可以解決的科學問題?

原位空間組學可以解決的科學問題?

06

亞細胞分辨率可以鑒定細胞間相互作用,挖掘病理狀態,了解疾病背后的生物學機制;Xenium原位分析數據與單細胞數據進行直接比較,實現對腫瘤微環境中細胞類型的解析、不同基因表達的分析;

改成空間多組學的應用領域

病理學

通過添加基因表達維度,得出形態學結論;

通過觀察基因表達區域,了解可能發生假陰性/假陽性的位置

腫瘤學

腫瘤微環境及腫瘤異質性,研究空間位置上腫瘤組織與癌旁、正常組織基因表達的區別;

腫瘤發生發展、浸潤、轉移等不同階段腫瘤細胞的變化對正常細胞的影響

免疫學

免疫細胞浸潤、不同區域的免疫細胞中的基因表達特征;

免疫群體擴散、不同類型免疫細胞的空間位置解析

神經科學

大腦皮層層狀組織解析,揭示大腦皮層的結構-功能關系;

正常vs.疾病大腦結構特征分析與疾病相關的基因表達于特定的大腦皮層

發育生物學

通過解析每個發育階段不同解剖區域特有的基因表達特征,解析組織中與形態形成相關基因;

豐富基因表達的空間注釋信息,創建組織發育的空間細胞圖譜

空間多組學優勢

01      

提供實驗操作更精細的冷凍解決方案

- 烈冰配置了LEICA?CM1950冷凍切片機,搭配切片經驗豐富的實驗團隊,可以提供一致性更高、實驗操作更精細的冷凍切片準備方案

- 保持密切高效的溝通,設計更適合的實驗方案,確保每一個實驗細節有效進行



02      

高清明場和熒光場拍攝成像解決方案

- 烈冰升級配置尼康相差顯微鏡和CCD成像系統,更高清分辨率解析組織切片原始圖像信息

- 10X,20X,40X,60X更多物鏡選擇,為不同大小的樣本提供更清晰的圖像

- 更精細的圖像信息采集、拼接策略,為樣本內微小區域的組織學提供更清晰的影像


03      

烈冰CytoNavigator云分析平臺

- 原拖拽式頁面全新升級,真正實現分析0代碼,?信不求?,助力用戶挖掘數據背后的生物學意義

- 解決空間轉錄組測序數據分析中由于超大數據量、超高的質控要求以及繁多分析需求而引起的分析困難

- 做到快速可定制化完成空間轉錄組分析


04      

提供免疫組化(Immunohistochemistry)和熒光原位雜交(FISH)服務

- 擁有行業先進的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的數字切片掃描儀,可以同時實現明場與熒光場下冷凍切片的快速掃描成像;

- Z-Stack多層聚焦掃描及Extended Focus 景深擴展多層融合掃描模式,進一步提升分辨率和清晰度,保證切片高分辨的數字圖像信息精準采集;

- 能夠滿足針對分析結果中感興趣基因的RNA-FISH驗證以及組織切片的免疫組化的高清成像,獲取表達與定位信息。

05      

定制化一站式服務

- 烈冰生物真正實現空間轉錄組測序的全程把控,做到從實驗設計、空間信息標記、建庫測序、定制化分析的全流程一站式服務,助力高分文章發表

- 資深的實驗團隊保證樣本的高度一致性;專業的生物學團隊提供個性化的產品應用場景解讀、保持對生物學意義的關注;強大的生信分析團隊一對一地進行詳實科學的實驗方案設計并提供多次售后分析



實驗流程

樣本要求

可接受樣品類別

  • 冰凍組織:新鮮樣本經液氮預冷的異戊烷速凍,-80℃保存
  • OCT包埋組織:新鮮組織異戊烷速凍后進行OCT包埋,或新鮮組織直接OCT包埋后-80℃速凍,注意標明樣本方向,樣本于-80℃保存

樣本處理和運輸過程需要在低溫環境

Xenium:

  • 新鮮冷凍(FF)樣本:新鮮組織OCT包埋后-80℃速凍,可連同包埋模具一同保存運輸,在包埋模具上好做方向標記,用于確定切片方向;
  • 石蠟包埋(FFPE)樣本:包埋好的石蠟塊或石蠟切片3-5張,4℃保存,干燥運輸

其它注意事項:

1.可聯系烈冰提供Xenium專用玻片,由老師自行貼片,樣本處理和運輸過程需要在低溫環境
2.多樣本拼片,需保證同一玻片選擇的Panel相同
3.組織大小要長寬小于10.45mm*22.45mm(實際捕獲區域大?。?br> 4.切片質檢:HE染色質控判斷組織形態、空間信息保留是否完好,DV200 > 30%(DV200 為檢測樣品中大于 200nt 的 RNA 百分比)
5.目前商業化panel僅支持人和小鼠物種(可定制增加100 genes),具有注釋良好的轉錄組的其它物種需要提前定制設計(具體細節請在送樣前與我司進行提前溝通)

結果展示

點陣亞群分析

基于每個點陣的基因表達量,采用聚類算法對細胞進行亞群分析,同時采用t-SNE分析對各點陣的空間排布進行可視化展示

解剖區域細分

以每個點陣中的表達量數據為研究對象,根據指定的解剖區域(臨近切片或者當前切片)進行結果展示,包括基因區域的集中展示

點陣簇Marker基因分析

可視化展示不同點陣亞群中Marker基因的表達分布:Aldoc星狀膠質;GAdl抑制性神經元;Mbp少突膠質細胞;Slc17a6興奮性神經元

信號通路富集分析

采用個性化分析策略,在研究者關注的點陣、區域、樣本中分析研究者關注的基因集

細胞通訊分析

采用Cellphone算法,針對不同點陣亞群cluster之間或內部的Ligand-Receptor關系進行分析,展示了微環境中跨細胞類型的通訊關系,幫助解析微環境的形成機制和調控機理

文獻案例

整合空間和單核轉錄組數據闡明了具有抑郁樣行為的雌性食蟹猴的小膠質細胞特異性反應

發表時間:2023 年 7 月

發表期刊:Nature Neuroscience

影響因子:25

發表單位:重慶醫科大學附屬第一醫院


研究背景:根據世界衛生組織(WHO)的數據,自2017年以來,重度抑郁癥(MDD)已成為世界上最主要的殘疾原因之一,其潛在的細胞和分子機制已有研究者對于男性的MDD基于單細胞分辨率進行初步探索(Corina Nagy, Nat Neurosci, 2020)。


研究方法:單細胞核測序、空間轉錄組(Visium ST)測序


研究結果:

基于單細胞測序、空間轉錄組測序等多種技術手段,揭示了細胞類型和皮層特 異性基因表達的變化特征。共鑒定出 8個細胞大類,240 個不重復的差異表達基因,這些基因主要富集在膠質細胞;研究者同時采用共表達網絡分析鎖定了小膠質細胞是低等級抑郁猴中改變的關鍵細胞群;亞型分析發現了抑郁猴富集的小膠質亞型,將其命名為“抑郁相關小膠質細胞(PIMID);進一步采用 WGCNA 分析空間組學數據,揭示了抑郁行為、積極以及消極情緒行為模塊對于基因在空間分布上的差異,而 PIMID主要定位于猴腦解剖腦的第 6 層,以上成果為抑郁癥的靶向干預提供潛在新靶點。


對導管細胞細分為四個亞群:缺氧區域導管、腺泡中心導管、尾端導管和抗原遞呈導管。并用各個亞群的marker基因與空間轉錄組數據進行聯合分析。發現缺氧導管和尾端導管在腫瘤區域富集。腫瘤組織的缺氧環境可能導致腫瘤區域的導管細胞內缺氧相關基因的表達。



【1】Schwann cells regulate tumor cells and cancer-associated fibroblasts in the pancreatic ductal adenocarcinoma microenvironment

發表時間:202307;發表期刊:Nature Communications;影響因子:16.6;物種:人;組織:胰腺組織

【2】Targeting neoadjuvant chemotherapy-induced metabolic reprogramming in pancreatic cancer promotes anti-tumor immunity and chemo-response

發表時間:202310;發表期刊:Cell Reports Medicine;影響因子:14.3;物種:人;組織:胰腺組織

【3】Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma

發表時間:202303;發表期刊:Cell Discovery;影響因子:33.5;物種:人;組織:口腔組織

【4】Integrating spatial and single-nucleus transcriptomic data elucidates microglial-specific responses in female cynomolgus macaques with depressive-like behaviors

發表時間:202307;發表期刊:Nature Neuroscience;影響因子:25;物種:獼猴;組織:腦組織

【5】High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue (單細胞、空轉和原位分析(Xenium)聯合解析乳腺癌石蠟切片腫瘤微環境)

發表時間:20231219;發表期刊:Nature Communications;物種:人;組織:乳腺癌組織

【6】Decoding spatial organization maps and context-specific landscapes of breast cancer and its microenvironment via high-resolution spatial transcriptomic analysis (高分辨率空間轉錄組學分析(Xenium)解碼乳腺癌和從屬微環境的空間組織解構及其成因)

發表時間:20231030;發表期刊:bioRxiv;物種:人;組織:乳腺癌組織

【7】Single cell-resolution in situ sequencing elucidates spatial dynamics of multiple sclerosis lesion and disease evolution (單細胞尺度級別的原位測序(Xenium)揭示了多發性硬化癥病變和疾病演變的空間動態)

發表時間:20230630;發表期刊:bioRxiv;物種:小鼠;組織:頸脊髓

【8】Mapping ovarian cancer spatial organization uncovers immune evasion drivers at the genetic, cellular, and tissue level (原位空間組學揭示了卵巢癌的免疫逃逸在基因-細胞-組織水平上的驅動機制)

發表時間:20231019;發表期刊:bioRxiv;物種:人;組織:卵巢癌組織

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