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【烈冰助力】單細胞技術揭示腫瘤細胞驅動的免疫逃逸機制 時間:2023-03-31


癌癥的特征之一是逃避免疫系統殺傷,N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中一種常見的內源性修飾。研究表明,m6A甲基化在逃避免疫系統破壞中具有重要功能。YTHDF1是一種多功能、強大的m6A reader,近年來在抗腫瘤免疫調節中的作用逐漸成為研究熱點,但YTHDF1對免疫逃逸的影響還知之甚少。

近日,烈冰合作伙伴上海質子重離子醫院孔琳教授團隊在Nature Communications(IF=17.694)上發表了題為“Tumor-intrinsic YTHDF1 drives immune evasion and resistance to immune checkpoint inhibitors via promoting MHC-I degradation”的論著。該研究通過單細胞測序技術(scRNA-seq)揭示了腫瘤固有的YTHDF1驅動免疫逃逸免疫檢查點抑制劑(ICI)抵抗,YTHDF1缺失促使免疫系統恢復監測。

烈冰生物承擔了本研究中的單細胞測序數據分析工作,下面跟隨小編的步伐,一起來看看本文的實驗設計和研究成果吧~


實驗設計

單細胞實驗分組Ythdf1-KO腫瘤(n = 3),WT腫瘤(n = 3)

主要技術手段CRISPR/Cas9基因編輯、轉錄組測序、單細胞測序、TMT蛋白質組、免疫組化、免疫熒光檢驗法、免疫沉淀(eCLIP)、Western blot等

捕獲細胞數:29325個CD45+免疫細胞

單細胞捕獲平臺:烈冰生物10x Genomics平臺

單細胞分析工具應用:烈冰生物NovelBrain®云平臺:細胞聚類、GO分析、Pathway分析、擬時序分析等


研究結果解析

01 YTHDF1與ICI耐藥性相關

基于TCGA-皮膚黑色素瘤(SKCM)數據集進行免疫評分,作者發現在m6A調控因子中,YTHDF1 RNA與免疫評分呈顯著負相關,提示其可能在調節免疫逃逸中發揮作用。單樣本基因集富集分析表明,腫瘤固有YTHDF1呈現“免疫荒漠表型。此外,對ICI治療具有耐藥性的黑色素瘤B16/F10細胞系中,YTHDF1表達顯著上調。通過分析現有轉錄組數據,YTHDF1的高表達與ICI治療的耐藥性有關,與其他m6A reader相比,YTHDF1發揮了更重要的作用。


圖1 YTHDF1與“免疫荒漠”表型和ICI耐藥性相關

02 YTHDF1缺失抑制腫瘤生成

基于CRISPR/Cas9系統,作者構建了Ythdf1缺失的黑色素瘤B16/F10細胞(Ythdf1-KO),發現其與野生型B16/F10細胞(WT)在增殖能力和活力上沒有差異。進一步皮下注射到正常/免疫缺陷小鼠中發現:免疫缺陷小鼠中,Ythdf1-KO組與WT組之間的腫瘤體積和重量沒有差異;在正常小鼠中,YTHDF1缺失顯著抑制了腫瘤的生成。


圖2 YTHDF1缺失抑制正常小鼠的腫瘤生成


03 Ythdf1-KO和WT小鼠腫瘤的免疫景觀

       為了進一步揭示免疫微環境的異質性,作者進行了單細胞轉錄組測序(Ythdf1-KO和WT腫瘤浸潤CD45+免疫細胞),獲得了22個細胞亞群并進一步劃分為10種免疫細胞群體。其中T細胞、NK細胞和增殖混合免疫細胞在Ythdf1-KO腫瘤中富集,而中性粒細胞和B細胞在WT腫瘤中浸潤程度更高。細胞類型和占比在KO組和WT組之間表現出明顯的差異。


圖3 Ythdf1-KO和WT小鼠腫瘤的免疫微環境

       深入研究發現,在CD4+ T細胞進一步可細分為naive CD4+ T細胞、effector memory CD4+ T細胞(CD4+ TEMs)、regulatory CD4+ T細胞(Tregs)、proliferating CD4+ T細胞和IFN-responsive CD4+ T細胞。其中KO組中naive CD4+ T細胞只占6%,而CD4+ TEMs,Tregs等相較于WT組明顯增加。KEGG和GO富集結果均顯示,一系列免疫相關通路(如:抗原加工和呈遞、T細胞受體信號通路等)在CD4+ TEMs、proliferating CD4+ T細胞中上調。綜上,KO組中proliferating CD4+ T細胞CD4+ TEMs亞型免疫功能強于WT組。

圖4 CD4+ T細胞分析結果

        CD8+ T細胞可進一步細分為4種T細胞亞型,其中KO組腫瘤表現出更多的CD8+ T細胞浸潤。體外細胞毒性實驗顯示,KO組腫瘤浸潤CD8+ T細胞比WT組具有更強的體外殺傷能力。而大量中性粒細胞(特別是腫瘤相關中性粒細胞)多浸潤在WT腫瘤中。如上結果說明腫瘤固有YTHDF1缺失促進了抗腫瘤免疫細胞的浸潤,并通過重新構建TME來減少促腫瘤免疫細胞。

圖5 CD8+ T細胞分析結果


04 YTHDF1缺失增強了ICI治療效果

       通過比較WT組和KO組之間的免疫檢查點分子發現,在腫瘤細胞中,YTHDF1缺失會增加PD-L1蛋白在體內的表達,而抗PD-L1或抗CTLA-4抗體治療可以顯著減小Ythdf1-KO組的腫瘤體積。其中87.5%的抗CTLA-4和75%抗PD-L1治療的小鼠表現出了腫瘤完全排斥并實現無瘤生存。YTHDF1缺失將冷腫瘤轉化為熱腫瘤,其與ICI協同治療顯著延長總生存期;攜帶Ythdf1-KO細胞、并被ICI治愈的小鼠可以抵抗WT腫瘤的再次攻擊,這表明這種聯合療法可以引發有效、持久的免疫記憶,避免腫瘤復發。


圖6 YTHDF1缺失會增強ICI治療效果

       結合蛋白質組學,YTHDF1缺失抑制了溶酶體基因的翻譯過程,并限制了MHC-I和抗原的溶酶體蛋白水解,最終增強了免疫系統對腫瘤的識別能力,恢復腫瘤免疫監測。

圖7 YTHDF1促進MHC-I水解

       此外,團隊進一步設計了一個外泌體介導的CRISPR/Cas9傳遞系統,在體內靶向結合Ythdf1基因。發現KO外泌體治療組中,小鼠體內B16/F10細胞的生長明顯受到抑制,YTHDF1的表達明顯減少,腫瘤浸潤CD4+和CD8+ T細胞數量增加,抗腫瘤活性增強。同時該方法的安全性也得到了證實:外泌體介導的YTHDF1缺失可通過激活抗腫瘤免疫反應來抑制腫瘤生長。

圖8 外泌體介導的YTHDF1缺失通過恢復體內抗腫瘤免疫來延緩腫瘤生成


全文總結

綜上,本研究闡明了腫瘤固有YTHDF1在驅動免疫逃逸中的作用及其潛在機制。YTHDF1缺失可增強CD8+和CD4+ T細胞的浸潤來改變TME的組成,同時也會限制MHC-I和抗原的水解,最終恢復腫瘤免疫監測,并引發了強大的抗腫瘤免疫。此外,該研究開發了一種外泌體誘導的CRISPR/Cas9傳遞系統,該系統可消耗YTHDF1并恢復腫瘤免疫監測,為抑制和治療腫瘤細胞提供新的研究思路。

圖9 YTHDF1驅動免疫逃逸的機制



上海質子重離子醫院孔琳教授為本文的通訊作者,上海質子重離子醫院林萬尊為本文第一作者。


本研究詳細信息參見原文鏈接:10.1038/s41467-022-35710-7











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